La Chapelle Sixtine, dite "Chapelle de la Crèche", a été commandée par le Pape Sixte entre 1585 et 1587. Domenico Fontana, l'architecte de confiance du pape, réalisa la plus grande chapelle de Rome à l'époque, selon un plan en croix grecque avec deux chapelles annexes. Posée sur un tambour ajouré par huit grandes fenêtres, elle couronne l'oratoire de la crèche situé à l'étage inférieur et auquel on accède par un double escalier. L'oratoire, adossé à l'origine à la nef droite de la Basilique et datant du haut Moyen-Âge, reproduit la grotte de la nativité de Bethléem. Le Tabernacle en bronze doré de Ludovico del Duca est un élément théologique clé de l'ensemble de la Chapelle Sixtine. Avec ses portiques et ses colonnes recouvertes de vigne, il rappelle le Temple de Salomon et exprime avant tout le sens littéral du nom de la ville où est né Jésus : "Bethléem", la maison du pain.
L'exécution des fresques et des stucs fut confiée à une équipe de nombreux artistes, sous la direction de Cesare Nebbia et de Giovanni Guerra. Leurs œuvres illustrent l'histoire de l'enfance de Jésus.
Sur les côtés se trouvent les tombes des commissaires Sixte V et Saint Pie V.