A Capela Sistina, conhecida como a "Capela do Presépio", foi encomendada pelo Papa Sisto entre 1585 e 1587. Domenico Fontana, o arquiteto de confiança do Papa, construiu a maior capela de Roma na época em uma planta de cruz grega com duas capelas subsidiárias. Situada em um tambor perfurado por oito grandes janelas, ela coroa o oratório do presépio localizado no andar inferior e acessado por uma escada dupla. O oratório, originalmente encostado na nave direita da Basílica e que remonta ao início da Idade Média, reproduz a gruta da natividade de Belém. O Tabernáculo de Ludovico del Duca em bronze dourado é um elemento teológico fundamental de toda a Capela Sistina. Com seus pórticos e colunas envoltas em videiras, lembra o Templo de Salomão e expressa, acima de tudo, o significado literal do nome da cidade onde Jesus nasceu: "Belém", a casa do pão.
A execução dos afrescos e do trabalho em estuque foi confiada a uma equipe de vários artistas, sob a direção de Cesare Nebbia e Giovanni Guerra. Suas obras ilustram a história da infância de Jesus.
Nas laterais estão os túmulos do comitentes Sisto V e de São Pio V.