Kaplica Sykstyńska (Cappella Sistina), znana jako „kaplica Żłóbka” (del Presepe), została zlecona przez papieża Sykstusa w latach 1585-1587. Cieszący się zaufaniem papieża architekt Domenico Fontana zbudował więc największą wtedy w Rzymie kaplicę na planie krzyża greckiego z dwiema kaplicami bocznymi. Mieszcząca się w okrągłej przestrzeni, oświetlonej ośmioma dużymi oknami, stanowi zwieńczenie znajdującej się na niższej kondygnacji właściwej Kaplicy Żłóbka, do której prowadzą dwie rampy schodów. Kaplica Żłóbka, pierwotnie usytuowana w prawej nawie bazyliki, wykonana została we wczesnym średniowieczu i stanowi odtworzenie groty betlejemskiej. Zasadniczym elementem całej Kaplicy Sykstyńskiej jest Tabernakulum wykonane przez Ludovica del Duca ze złoconego brązu. Zdobieniem i spowitymi winoroślą kolumnami przypomina Świątynię Salomona, symbolizując dosłowne znaczenie nazwy miasta, gdzie urodził się Jezus: Betlejem, czyli „dom chleba”.
Wykonanie fresków i sztukaterii w Kaplicy, obrazujących historię narodzin Jezusa, powierzono grupie artystów pod kierunkiem Cezarego Nebbii i Giovanniego Guerry.
Na bocznych ścianach znajdują się pomniki nagrobne zleceniodawcy papieża Sykstusa V i św. Piusa V.