La Capilla Sixtina, conocida como "la Capilla de la Natividad/ del Belén", fue encargada por el Papa Sixto entre 1585 y 1587. Domenico Fontana, el arquitecto de confianza del Papa, construyó la capilla más grande de Roma en ese momento en planta de cruz griega con dos capillas auxiliares. Instalado sobre un tambor atravesado por ocho grandes ventanales, corona el oratorio del belén situado en la planta baja y al que se accede a través de una doble escalera. El oratorio, originalmente adosado a la nave derecha de la Basílica y cuyo núcleo data de la Alta Edad Media, reproduce la cueva de la Natividad de Belén. El Tabernáculo de Ludovico del Duca en bronce dorado es un elemento teológico clave de toda la Capilla Sixtina. Con sus pórticos y columnas envueltas en enredaderas, hace referencia al Templo de Salomón y expresa ante todo el significado literal del nombre de la ciudad donde nació Jesús: "Belén", la casa del pan.
La ejecución de los frescos y estucos fue confiada a un equipo de numerosos artistas, bajo la dirección de Cesare Nebbia y Giovanni Guerra. Sus obras ilustran la historia de la infancia de Jesús.
En los laterales se encuentran los monumentos funerarios del mecenas Sixto V y de San Pío V.